O professor Martin Chalfie ganhou o prêmio Nobel de Química em 2008, juntamente com os professores Osamu Shimomura e Roger Tsien, pela descoberta e desenvolvimento da proteína fluorescente verde, PFV. 

A água-viva brilhante e um erro milagroso

Você já teve a sorte de presenciar o fenômeno surpreendentemente belo de um vaga-lume brilhante iluminando uma noite escura? Os vaga-lumes fazem parte de um grupo fascinante de organismos capazes de produzir luz – um fenômeno chamado bioluminescência. Outros organismos bioluminescentes incluem alguns tipos de vermes, de bactérias e de peixes. Nossa história começa com uma água-viva bioluminescente chamada Aequorea victoria, ou A. victoria, abreviadamente (Figura 1). 

Nos anos 1960, um cientista japonês chamado Osamu Shimomura queria entender como os organismos bioluminescentes produzem luz. Decidiu trabalhar com a A. victoria, que emite luz verde. Osamu trabalhou um verão inteiro, tentando fazer as células da A. victoria brilharem (como acontece naturalmente no mar), mas nenhum desses experimentos teve sucesso.

Uma noite, quando já estava escuro lá fora, Osamu, antes de ir para casa jantar, jogou suas amostras de A. victoria de outro experimento fracassado na pia, apagou a luz para fechar o laboratório e ia sair quando percebeu que a pia estava brilhando com uma tonalidade azul. Como a pia também contivesse água do mar, Osamu concluiu que algo nessa água devia ter desencadeado a produção de luz. Logo percebeu que o cálcio da água do mar fazia com que as proteínas das águas-vivas brilhassem. Chamou a proteína de brilho azulado de aequorina, em alusão ao nome da água-viva [1,2]. 

Após essa grande descoberta, Osamu teve que responder a outra pergunta candente: por que a aequorina gera luz azul se a água-viva de onde ela vem brilha com uma tonalidade verde? Ao purificar a proteína aequorina, Osamu procurou outra coisa que pudesse criar a luz verde emitida pela A. victoria. Por fim, encontrou outra proteína que era uma molécula fluorescente porque pegava a luz azul, vinda da aequorina ou de uma lâmpada portátil, e a convertia em luz verde.

Essa foi outra descoberta surpreendente, pois naquela época ninguém fazia ideia de que as proteínas podiam ser fluorescentes. Osamu, a princípio, deu a essa proteína o nome de “proteína verde”, mas hoje a chamamos de proteína fluorescente verde ou PFV [3]. Temos aqui uma história que é também um exemplo maravilhoso de como muitas descobertas científicas são puramente acidentais. O papel do cientista, como no caso de Osamu, consiste em perceber, questionar e investigar essas descobertas acidentais. 

Como a PFV mudou minha vida

No dia 25 de abril de 1989, uma terça-feira, ouvi uma palestra na hora do almoço, em minha universidade, sobre o trabalho de Osamu Shimomura a respeito da PFV. Assim que ouvi falar da PFV, fiquei fascinado.

 Meu laboratório estava trabalhando com um minúsculo (cerca de 1 mm de comprimento) verme transparente chamado Caenorhabditis elegans, ou C. elegans. Estávamos estudando um grupo de células nervosas desse verme que respondem a estímulos físicos, como o toque e o som, e os convertem em sinais elétricos e químicos. Perguntei-me se poderíamos encontrar uma maneira de fazer com que as células nervosas do C. elegans produzissem PFV, para conseguirmos realmente vê-las e estudá-las de uma maneira completamente nova. A PFV poderia então ser usada como um marcador biológico (uma molécula biológica que os cientistas observam para saber o que está acontecendo dentro de células ou organismos).

Na época, o método que usávamos para ver tipos específicos de células no C. elegans era complicado e não nos permitia trabalhar com tecidos vivos. Essas eram limitações sérias. Primeiro, tínhamos que pôr o verme “em conserva” com produtos químicos para preservar a estrutura celular, mas esse processo também matava o animal. Isso significava que aquele método nos dava apenas uma imagem “instantânea” do que estava acontecendo dentro do verme – um “quadro” de cada vez. Eu pensava que a PFV poderia nos permitir visualizar as células nervosas do C. elegans enquanto estava vivo e interagindo com o ambiente. 

Fiquei tão entusiasmado que nem consegui ouvir o resto da palestra. Nos dias seguintes, só pensava na PFV e seu potencial para minha pesquisa. Entrei em contato com um pesquisador chamado Douglas Prasher, que estava trabalhando na produção e cópia das instruções genéticas (DNA) que codificam a proteína PFV. Estávamos ambos entusiasmados com a possibilidade de usar a PFV no C. elegans e em outros organismos, por isso decidimos colaborar.

Depois de afastados por alguns anos devido a um infeliz mal-entendido, voltamos a fazer contato em 1992, quando uma estudante chamada Ghia Euskirchen veio ao meu laboratório e se interessou pelo projeto. Ela tinha uma boa experiência no trabalho com fluorescência e isso me trouxe de novo à mente a ideia de usar a PFV para marcar células vivas. Examinando alguns artigos científicos publicados sobre a PFV, descobrimos que Douglas escrevera recentemente um artigo sobre o assunto [4] e ligamos para ele. Pouco depois, Douglas nos enviou o código de DNA da PFV e Ghia começou a trabalhar com esse material. 

Organismos que brilham com a PFV

Quando Ghia iniciou suas experiências com a PFV, ela queria descobrir se as bactérias com o DNA que codifica a PFV se tornariam fluorescentes. Naquela época, não sabíamos se a produção da proteína PFV a partir do DNA da PFV bastava para tornar uma célula fluorescente (para mais informações sobre como as proteínas são feitas a partir do DNA, consulte este artigo). Podia ser que algo mais fosse necessário – algo que a própria célula produzia e adicionava à proteína PFV para torná-la fluorescente ou que devesse ser adicionado externamente para a produção desse fenômeno. 

A primeira decisão que tomamos no início do experimento envolvia o que fazer com o DNA da PFV que obtivéramos de Douglas. O DNA que Douglas nos enviou continha sequências extras além da seção codificada para a PFV (Figura 2A). 

Sabíamos ser necessário fazer muitas cópias do DNA da PFV para nossos experimentos e a questão era se devíamos usar o DNA inteiro (isto é, com os pedaços extras) ou trabalhar apenas com a parte codificada para a PFV. A parte complicada era que o método fora usado para obter somente o DNA codificador, chamado reação em cadeia da polimerase (ou RCP – que você deve conhecer pelos testes para a COVID-19) [5], e muitas vezes ele introduz erros no DNA copiado. Apesar dessa limitação, decidi que usaríamos a RCP, pois iríamos observar milhões de bactérias e algumas delas teriam o DNA da PFV sem erros. 

No final das contas, escolhemos a estratégia certa. Ghia usou a RCP para copiar o DNA da PFV. Ela em seguida incorporou esse DNA a uma molécula de DNA chamada plasmídeo, que as bactérias “engolem” e integram a seu próprio DNA. Após emitir luz azul na E.  coli contendo DNA da PFV, elas se tornaram fluorescentes [6]. (Ao contrário, os outros grupos que usaram o DNA da PFV original com o DNA adicional não apresentaram fluorescência. Alguma coisa no DNA extra interferia na produção de PFV. Se não houvéssemos usado a RCP, nosso experimento não teria funcionado.) Como nosso método funcionou nas bactérias, resolvemos usá-lo para incorporar o DNA da PFV ao C. elegans, como eu originalmente planejava fazer – e o C. elegans brilhou também (Figura 2B)! Isso abriu caminho para a incorporação da PFV a todos os tipos de organismos e seu uso em diversas aplicações. 

Como a PFV mudou a ciência

Todo desenvolvimento científico novo nos dá um melhor entendimento de princípios físicos ou biológicos básicos e, também, ajuda na criação de novas tecnologias. Muitas vezes, a descoberta original toma rumos surpreendentes e inesperados ao longo do tempo. A descoberta do laser é um bom exemplo. Charles Townes, cujo trabalho levou à descoberta do laser, nunca imaginou que ele seria útil em supermercados para escanear os preços dos produtos, ou na indústria fonográfica para fabricar discos compactos, ou na indústria cinematográfica para fazer DVDs ou na medicina para realizar cirurgias a laser. O mesmo se aplica à descoberta da PFV – ela evolui e continuará a evoluir, em muitas direções diferentes que promovem tanto conhecimentos científicos fundamentais quanto várias aplicações tecnológicas. 

Na pesquisa científica, a PFV é usada como marcador biológico para nos informar sobre a atividade dos genes e seus produtos. Imagine os genes como constituídos de duas partes: a parte codificadora, que indica qual produto deve ser produzido (o RNA e a proteína), e a parte reguladora, que diz onde, quando e quanto do produto deve ser produzido. Se a sequência de DNA da PFV for adicionada à parte regulatória, a PFV será produzida e apresentará fluorescência sempre que o gene normal for “ligado”.

Alternativamente, se a sequência de DNA da PFV for adicionada ao sequenciamento de codificação, a proteína normal terá a proteína PFV ligada a ela e brilhará quando incidirmos luz azul sobre ela [7]. Podemos ver onde as proteínas residem nas células (por exemplo, no núcleo, na membrana celular) e também observá-las enquanto se movem através das células vivas, um processo que não era possível com métodos anteriores.

É importante ressaltar que, uma vez inserido o DNA da PFV no DNA de um organismo, ele pode ser transmitido aos descendentes desse organismo – o que torna o uso experimental da PFV muito conveniente. 

Gostaria de mencionar duas descobertas feitas com PFV que admiro pessoalmente. A primeira foi feita por Clifford Brangwynne e Anthony Hyman em 2009 [8]. Eles observavam proteínas dentro do citoplasma – o líquido no interior das células. Até então, pensava-se que o citoplasma fosse bastante uniforme, mas, ao observar uma certa proteína citoplasmática marcada pela PFV, viu-se que ela parecia conter partículas que estavam separadas do resto do citoplasma. Essas partículas agiam como pequenas gotas de óleo na água – às vezes, se juntavam e fundiam, outras vezes se dividiam em duas. Essas estruturas não se misturavam com o resto do citoplasma, eram uma fase separada (são frequentemente chamadas de partículas de fase separada [Figura 3ª]). Essa descoberta acabou sendo importante para nossa compreensão da estrutura e função das células, e inaugurou uma área rica de pesquisa. 

Outro experimento com a PFV de que eu particularmente gostei muito foi feito por Geoff Waldo [9]. Geoff encontrou uma maneira inteligente de usar a PFV para monitorar o dobramento de proteínas; ele a chamou de “repórter dobrável”.

Depois que uma proteína é produzida como uma longa cadeia de blocos de construção chamados aminoácidos, ela deve se dobrar em uma estrutura tridimensional específica para desempenhar sua função. Se ela proteína se dobra incorretamente, não funciona bem. Quando estudamos proteínas produzindo-as em bactérias, por exemplo, queremos ter certeza de que estão bem dobradas. Geoff produziu um DNA que codificava as proteínas em que estava interessado e a PFV. Calculou que, se a proteína não se dobrasse direito, então a PFV também não se dobraria adequadamente e não brilharia. Assim, se visse células fluorescentes, concluiria que a proteína em exame se dobrara corretamente e, se não visse células fluorescentes, concluiria que a proteína se dobrara incorretamente. Essa é uma boa maneira de garantir que os cientistas trabalhem com proteínas dobradas corretamente (Figura 3B). 

Recomendações para as Mentes Jovens

Não creio que exista uma “receita” para fazer pesquisas científicas importantes, mas há coisas que considero imprescindíveis.

Uma das habilidades mais significativas de um cientista bem-sucedido é a de responder a perguntas. Muitas perguntas importantes estão bem debaixo de nossos narizes, esperando para serem feitas, mas, se não tivermos o hábito de fazê-las, elas passarão em branco. Quando você aprende algo novo, pergunte a si mesmo como o que você aprendeu poderá ser aplicado a outros tópicos nos quais esteja interessado. Essa é uma abordagem proveitosa que adoto o tempo todo em meu trabalho. Outro aspecto útil do hábito de fazer perguntas é o questionamento de nossas suposições (Figura 4) – por que devemos acreditar naquilo em que acreditamos? Muitas vezes, quando examinamos nossas suposições desse modo, encontramos erros nelas. Corrigi-los atualizando nossas suposições pode ajudar-nos a avançar em conhecimento e compreensão. 

Frequentemente, recomendo que os estudantes trabalhem em duas coisas ao mesmo tempo. Dessa forma, se um projeto não estiver funcionando, eles ainda terão o outro para obter sucesso e motivação. A ciência é uma jornada de luta contra o desconhecido. Nem sempre é fácil e pode se revelar frustrante, pois cometemos muitos erros ao longo do caminho. Nossas ideias às vezes não funcionam, mas avançar contra o desconhecido é uma parte emocionante de ser um cientista. Ocasionalmente, essa jornada desafiadora traz grandes recompensas, como descobrir algo que ninguém conhecia e depois compartilhar a descoberta com outras pessoas. 

Finalmente, não se preocupe muito com suas notas. As notas podem não ter absolutamente nada a ver com sucesso na ciência. Acho que o entusiasmo e a persistência são muito mais importantes do que as notas. Tirei notas médias em química quando estava na universidade e acabei ganhando o prêmio Nobel em Química cerca de trinta anos depois (gosto da ironia disso). Se você está interessado em ciência, uma das melhores maneiras de se tornar bom nessa área é praticá-la. Tente fazer experimentos e descubra como se sente – essa é a maneira mais confiável de saber se a ciência é a escolha certa para você. 

Glossário

Bioluminescência: Produção de luz por organismos vivos. 

Aequorina: Proteína brilhante descoberta na água-viva Aequorea victoria pelo professor Osamu Shimomura.

Moléculas fluorescentes: Moléculas que convertem uma cor de luz (azul, por exemplo) em outra (verde, por exemplo). 

Proteína fluorescente verde (PFV): Proteína inicialmente identificada na água-viva A. victoria. Ela absorve a luz azul e a converte em luz verde. 

Células nervosas: Células do sistema nervoso que recebem informação do ambiente, processa-a usando sinais químicos e elétricos, e gera um produto, como movimento. 

Marcador biológico: Molécula biológica usada por pesquisadores para indicar um estado ou processo biológico. 

Reação em cadeia da polimerase: Método de laboratório usado para criar muitas cópias de um segmento específico de DNA usando uma enzima copiada de DNA chamada DNA polimerase. 

Gene: Segmento de DNA que carrega instruções para fazer uma proteína específica. 

Agradecimentos

Desejo agradecer a Noa Segeev por conduzir a entrevista que serviu de base para este artigo e por colaborar em sua redação; a Iris Gat por fornecer as figuras (https://www.irisgat-art.com/) e a Susan Debad pela preparação do manuscrito. 

Conflito de interesses

O autor declara que a pesquisa foi realizada sem nenhuma relação financeira ou comercial capaz de gerar um conflito de interesses. 

Referências

[1] Shimomura, O., Johnson, F. H. e Saiga, Y. 1962. “Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.” J. Cell. Compar. Physiol. 59:223–39. DOI: 10.1002/jcp.1030590302.

[2] Shimomura, O. 2009. “Discovery of green fluorescent protein (GPF) (Nobel Lecture).” Angew. Chem. Int. Ed. 48:5590–602. DOI: 10.1002/anie.200902240.

[3] Morin, J. G. e Hastings, J. W. (1971). “Energy transfer in a bioluminescent system.” J. Cell. Physiol. 77:313–8. DOI: 10.1002/jcp.1040770305.

[4] Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W.W., Prendergast, F. G. e Cormier, M. J. 1992. “Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.” Gene 111:229-33. DOI: 10.1016/0378-1119(92)90691-H.

[5] Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G. e Erlich, H. 1992. “Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.” Biotechnol. Ser. LI:17.

[6] Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. e Prasher, D. C. 1994. “Green fluorescent protein as a marker for gene expression.” Science 263:802–5. DOI: 10.1126/scince.8303295. 

[7] Wang, S. e Hazelrigg, T. 1994. “Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis.” Nature 369:400–3. DOI: 10.1038/369400a0.

[8] Brangwynne, C. P., Eckmann, C. R., Courson, D.S., Rybarska, A., Hoege, C., Gharakhani, J. et al. 2009. “Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation.” Science 324:1729–32. DOI: 10.1126/science.1172046.

[9] Waldo, G.S., Standish, B.M., Berendzen, J. e Terwilliger, T. C. (1999). “Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein.” Nat. Biotechnol. 17:691 – 5. DOI: 10.1038/10904.

[10] Hübner, W., McNerney, G. P., Chen, P., Dale, B. M., Gordon, R. E., Chuang, F. Y. et al. 2009. “Quantitative 3D vídeo microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.” Science 323:1743–7. DOI: 10.1126/science.1167525.

[11] Shemer, B., Palevsky, N., Yagur-Kroll, S. e Belkin, S. 2015. “Genetically engineered microorganisms for the detection of explosives’ residues.” Front. Microbiol. 6:1175 DOI: 10.3389/fmicb.2015.01175. 

[12] Shimizu, K. 2018. “Genetic engineered color silk: fabrication of a photonics material through a bioassisted technology.” Bioinspir. Biomimet. 13:041003. DOI: 10.1088/1748-3190/aabbe9. 

Citação

Chalfie, M. (2023). “Molecular flashlights that light up science.” Front Young Minds. 11:1104539. DOI: 10.3389/frym.2023.1104539.