O professor Eric Betzig ganhou o Prêmio Nobel de Química em 2014, juntamente com os professores Stefan Hell e William Moerner, pelo desenvolvimento da microscopia de fluorescência de super-resolução.

Como conseguimos ver coisas pequenas?

Quando olhamos para um objeto, estamos na verdade detectando a luz que retorna dele e atinge nossos olhos. Pense, por exemplo, em um submarino que utiliza o sonar. Ao navegar pelo oceano, o submarino emite ondas sonoras que, após se chocar com objetos subaquáticos como rochas e animais marinhos, retornam para ele (Figura 1A). Desse modo, a tripulação do submarino pode se orientar debaixo da água. O mesmo princípio se aplica quando desejamos observar, no laboratório, coisas como células ou organismos minúsculos. Fazemos incidir luz (ou alguma outra forma de radiação, como elétrons) sobre o objeto minúsculo  e observamos o que ele reflete. O tipo de radiação é determinado por uma medida chamada comprimento de onda. Como você deve saber, as ondas têm um padrão repetitivo de picos altos e vales baixos. O comprimento da onda é a distância entre dois picos (Figura 1B). 

Em termos de observação de um objeto minúsculo, o comprimento de onda da energia refletida por ele determina a resolução com a qual conseguimos vê-lo. Quanto mais curta for a onda, menores serão os objetos que conseguiremos ver. Você pode imaginar isso como dedos que estão tentando “sentir” um objeto (Figura 1C). Se os dedos forem grossos (ou seja, comprimentos de ondas longos), não poderemos sentir os detalhes sutis do objeto – seria como sentir características milimétricas com dedos rechonchudos.

Assim, se desejamos ver os pequenos detalhes de um objeto, temos duas escolhas. Primeiro, usaremos uma forma de radiação com um comprimento de onda muito pequeno, tal como os raios X. O problema é que a exposição prolongada à alta energia dos comprimentos de onda curtos pode matar os seres vivos, e por isso não convém usá-los para estudar células vivas ou organismos. A outra opção é encontrar algum truque que nos permita usar comprimentos de onda mais longos, que são menos energéticos, e ao mesmo tempo conseguir ver além dos limites desses comprimentos de onda. Essa é a ideia por trás da microscopia de super-resolução, termo para qualquer método de microscopia que nos permite ver além dos limites dos comprimentos de onda que ele utiliza. 

Antes do desenvolvimento da microscopia de super-resolução, podíamos ver objetos com o tamanho de cerca de 200 nanômetros (ou 0,0002 milímetros) – por exemplo, os compartimentos maiores dentro das células dos animais, e até organismos unicelulares, como as bactérias. Não podíamos ver organismos menores, como os vírus, nem partes menores de células de proteínas individuais ou outras moléculas menores (Figuras 2A, B).

A capacidade de ver seres vivos em uma resolução tão alta foi um grande avanço! Abriu um potencial totalmente novo para compreender melhor os processos mais fundamentais da vida. Detalhes que antes eram indetectáveis pelas técnicas convencionais da microscopia foram expostos diante de nossos olhos e geraram grande entusiasmo para o estudo dos mistérios da vida (Figura 3A, B).

O começo: microscopia de campo próximo

Quando iniciei meus estudos avançados na universidade em 1983, dois dos meus professores – Mike Isaacson e Aaron Lewis – tiveram a ideia louca de tentar romper aquilo que foi chamado de limite de difração de Abbe. Segundo esse conceito, a menor coisa que podemos ver usando as ondas de luz deve ter pelo menos metade do comprimento de onda dessa luz. Por exemplo, se o comprimento de onda fosse de 1mm, poderíamos ver objetos com pelo menos 0,5 mm de comprimento.

Meus professores pensavam ser capazes de ir além desse limite manipulando a luz de uma maneira específica. A ideia deles era baseada na primeira demonstração de rompimento do limite de difração de Abbe, realizada em 1972 [2]. A ideia básica consistia em fazer um furo minúsculo, muito menor que o comprimento de onda da luz, em uma pequena placa preta. Quando a placa fosse colocada muito perto do objeto a ser examinado, e a luz escapasse pelo buraco, ela iluminaria um ponto muito pequeno do objeto – bem menor que o comprimento de onda da luz. O objeto poderia então ser “escaneado” movendo-se a placa iluminada, ponto por ponto, ao longo do objeto. Usando esse truque, podemos realmente ver o objeto com resolução superior à resolução “natural” da luz que entra. Hoje, esse método é chamado de microscopia óptica de varredura de campo próximo [3, 4]. 

Esse foi o primeiro método de microscopia de super-resolução com que trabalhei. O problema dele é que a luz que passa pelo pequeno orifício se espalha muito rapidamente do outro lado. Para obter alta resolução, devemos trabalhar extremamente perto do objeto que estamos visualizando. No caso das células, por exemplo, isso é um desafio porque elas não são planas, o que dificulta controlar a placa em cima delas. Depois de trabalhar com esse método durante vários anos, e levá-lo tão longe quanto achei possível, decidi abandoná-lo completamente, e também a ciência. Mal sabia eu que, alguns anos depois, um grande avanço no campo da bioquímica me traria de volta à ciência e à microscopia. 

Microscopia de fluorescência de super-resolução

Em 1994, foi publicado um estudo pioneiro [5] mostrando que, com a engenharia genética, podemos anexar uma alça brilhante, ou “marcador”, chamada proteína fluorescente, a qualquer proteína em células vivas. Essa é uma proteína especial que brilha quando um comprimento de onda específico de luz incide sobre ela. Percebi imediatamente que esse trabalho foi uma virada de jogo completa no campo da microscopia, porque poderia nos ajudar a ver as minúsculas estruturas do interior das células.

Um ano depois, em 1995, publiquei um artigo que apresentava as bases para um novo método de microscopia [6]. Mas foi só no início dos anos 2000 que avanços adicionais no campo de moléculas fluorescentes me permitiram retomar essa ideia. Os avanços criaram moléculas que nem sempre eram fluorescentes, mas poderiam ser “ativadas” para brilhar quando um determinado comprimento de onda de luz incidisse sobre elas [7]. Isso significava que poderíamos aplicar marcadores brilhantes a certas proteínas dentro das células vivas e ativá-las intencionalmente, para estudar estruturas e processos celulares. Esse foi o início do método da microscopia fluorescente de super- resolução que ajudei a desenvolver e que era originalmente chamado de microscopia de localização fotoativada (PALM) [8,9]. Em 2014, recebi o prêmio Nobel de Química por esse método. 

A ideia por trás da PALM é a seguinte: cada célula contém cerca de 20.000 tipos diferentes de proteínas, e às vezes há muitos milhares de unidades de cada tipo. Queremos saber como elas funcionam juntas. Usando um microscópio convencional, igual ao que é utilizado nas aulas de biologia na escola, tudo o que você pode ver, quando olha para essas proteínas nas células, é uma grande bolha brilhante. As proteínas estão tão próximas umas das outras que você não consegue diferenciá-las. No PALM, anexamos marcadores fluorescentes especiais às proteínas – marcadores que podem ser ativados por um laser de baixa potência (luz violeta) (Figura 4, etapa 1) e que depois brilham, tornando-se detectáveis quando um laser separado e de maior potência (luz azul) é direcionado a eles (Figura 4, etapa 2). 

Se ativássemos todos os marcadores de uma vez, todos brilhariam ao mesmo tempo, o que criaria uma enorme bagunça – é daí que vem a grande bolha brilhante. Por isso, usamos pulsos de luz violeta de energia muito baixa para ativar os marcadores – apenas alguns de cada vez, com cada pulso. Esses poucos marcadores são ativados aleatoriamente e provavelmente estão bem separados uns dos outros dentro da célula. Quando usamos luz azul para detectar esses marcadores ativados, eles se parecem com pequenas bolas brilhantes (Figura 4, etapa 2) com tamanho de aproximadamente 1 comprimento de onda de luz,  uma vez que este é o menor tamanho de um objeto que pode ser visto no microscópio convencional de difração limitada usado para observá-lo (figura 4, etapa 3). 

Agora, aqui está o truque: podemos usar um computador para processar a imagem obtida do microscópio e encontrar, com precisão, o centro de cada uma dessas “bolas”. Imagine-as como bolas de basquete com um determinado diâmetro. Você é capaz de apontar para o centro delas com uma precisão muito maior do que se calculasse seu diâmetro, ainda que não veja o centro diretamente. O mesmo é verdade para as bolas moleculares: podemos encontrar seus centros com precisão muito alta, muito mais próxima do seu tamanho real do que o tamanho das bolas brilhantes. Isso significa que, toda vez que dispararmos um pulso de luz nas células, podemos encontrar as posições de um pequeno conjunto de proteínas dentro delas (Figura 4, passo 3).

A fluorescência dessas proteínas desaparece naturalmente; então, iluminamos outro conjunto de proteínas e encontramos sua localização. Normalmente, são necessárias dezenas de milhares de rodadas de ativação para mapear uma célula inteira. Mas o esforço vale a pena, pois obtemos uma imagem de altíssima resolução da célula ou de qualquer outro objeto que estejamos estudando (ver Figura 3B e imagens em Betzig et al. [9]).

Os desafios e potenciais da microscopia de super-resolução

Como você viu, o PALM não é nada complicado: só precisamos de um laser para direcionar o feixe de luz sobre o objeto e de um programa de software relativamente simples para encontrar os centros das proteínas brilhantes. Esse equipamento é barato e fácil de utilizar. Na verdade, meu amigo, o prof. Harald Hess, e eu construímos o primeiro modelo de PALM na sala dele, com equipamentos que compramos com nosso próprio dinheiro quando estávamos ambos desempregados! A parte difícil é trabalhar com a amostra biológica. Existem muitos desafios, incluindo dificuldades na preparação de células vivas para as experiências, que podem ficar danificadas em resposta à luz, e a escolha da melhor forma de detectar e analisar a luz emitida pelas moléculas nas quais estamos interessados. 

Em termos de preparação das células, verifica-se que muitos dos marcadores ativados com luz não se ligam realmente às proteínas que queremos ver, mas sim a outros objetos próximos. Isso significa que, muitas vezes, os marcadores usados não nos indicam realmente a localização das proteínas de nosso interesse. Além disso, mesmo que consigamos rotular as proteínas corretas, só rotulamos uma pequena percentagem delas, e muitas vezes não é o suficiente para nos dar uma imagem completa da célula na resolução mais alta possível. Mesmo que consigamos rotular um número suficiente das proteínas certas, as células não gostam de receber luz intensa. No entanto, quanto mais intensa for a luz lançada sobre as células, mais informação poderemos obter. Portanto, estamos sempre tentando encontrar o equilíbrio entre extrair o máximo de informações possível e evitar danos às células. 

O último desafio que mencionarei aqui é um fenômeno chamado fotodegradação. A fotodegradação descreve o fato de que um marcador só pode brilhar um determinado número de vezes. Em outras palavras, apenas uma quantidade limitada de luz pode sair de um marcador específico antes que ele seja destruído ou se torne permanentemente escuro. Às vezes, essa quantidade de luz não basta para extrairmos a informação de que precisamos para encontrar a localização exata do marcador. 

Como mencionei anteriormente, a microscopia de fluorescência de super- resolução é única porque nos permite criar imagens de células e organismos vivos. Usando essa técnica, fazemos mais do que simplesmente determinar a estrutura dos seres vivos; também podemos rastrear processos que acontecem dentro de uma célula, como o movimento de proteínas, ao longo do tempo (veja este vídeo) [10,11]. Usando o chamado rastreamento de molécula única, podemos ver os mistérios mais profundos das células vivas e dar uma olhada nos processos mais básicos da vida. Por exemplo, o rastreamento de molécula única nos ajudou a entender como as cópias de RNA são feitas a partir do DNA que se acha dentro do núcleo de uma célula – um processo chamado transcrição. 

Rastrear moléculas individuais e descobrir como elas se movem dentro das células pode ser muito importante para o desenvolvimento de novos medicamentos. Na minha opinião, a informação obtida sobre mecanismos celulares que antes eram invisíveis deverá levar a um novo paradigma de descoberta de medicamentos e a novos tratamentos importantes para várias enfermidades, como o mal de Alzheimer e a doença de Parkinson Eis aí a melhor coisa que, a meu ver, surgirá da microscopia de super-resolução e é por isso que meus colegas e eu fundamos uma empresa de descoberta de novos medicamentos chamada Eikon Therapeutics©. 

Recomendações para mentes jovens

Como já mencionei, quando era criança, os personagens heroicos de fantasia e os astronautas me inspiravam. Eles representavam a chance de exercer impacto no mundo, e melhorar significativamente as vidas das pessoas. Para mim, esse é o maior objetivo que se pode ter na vida.

Portanto, aqui vai meu conselho: em sua carreira, faça sempre algo que provoque impacto, que dê uma contribuição significativa. Não precisa ser uma coisa muito grande: criar filhos é importante, assim como embalar produtos. Tente descobrir alguma coisa que seja uma mistura ideal de seus próprios interesses e que afete positivamente as pessoas ao seu redor ou a sociedade como um todo (Figura 5). Se você escolher ser cientista, não fique preso à ideia de se tornar um professor. Isso não deveria ser um objetivo em si, uma vez que existem muitas outras formas de fazer contribuições significativas e grandes descobertas fora do trabalho numa universidade. 

Pessoalmente, vejo inúmeras vantagens nas pesquisas que faço. Primeiro, sou meu próprio chefe. Isso me atrai porque gosto de tomar decisões sozinho, em vez de receber ordens. Segundo, no tipo de ciência que faço, tento inventar novas ferramentas para as pessoas empenhadas em responder às perguntas científicas que estão fora da minha especialidade. Isso significa que devo aprender muitas coisas novas e me transformar em “pau para toda obra”. Conheço um pouco sobre muitas coisas em diversas áreas – desde os materiais que funcionam melhor em diferentes máquinas até biologia, física e projetos de novos instrumentos de pesquisa. Esse amplo conhecimento inunda minha vida cotidiana e hoje entendo as coisas que vejo ao meu redor, e aprecio a beleza e a complexidade de meu mundo cotidiano. 

A última coisa que gostaria de discutir é a atitude a tomar em tudo que se faz. Primeiro, você nunca deve se esquecer de pensar criticamente sobre qualquer problema que enfrente. Não se satisfaça com o pensamento automático, superficial – tente observar as profundidades das coisas com que se depara. Segundo, não tenha medo de correr riscos. Em minha opinião, a sociedade se tornou muito refratária ao risco, o que limita nossa capacidade de inovar e avançar, como indivíduos e como sociedade.

Por último, o trabalho duro é decisivo! Não importa o que você faça, em qualquer idade, tente se esforçar e ao mesmo tempo se divertir. Não se culpe diante das dificuldades, mas faça esforços sérios para conseguir o que deseja. Se você não se destacar, tudo bem, porque cada qual é bom em uma coisa, ninguém é bom em tudo. Mas se esforce em tudo que fizer: o trabalho incansável levará você a qualquer lugar. Descubra aquilo que adora fazer, trabalhe duro, especialize-se, vá em frente, faça bom uso de seu talento e se divirta enquanto isso. 

Glossário

Radiação: Energia, em forma de ondas ou partículas, que é emitida de uma fonte. 

Comprimento de onda: Medida da distância entre dois picos adjacentes de uma onda. 

Microscopia de super-resolução: Qualquer método de microscopia que nos capacita a superar os limites dos comprimentos de onda que ele usa e, portanto, a observar objetos com maior resolução. 

Limite de difração de Abbe: Limite físico dos microscópios ópticos, devido ao qual podemos distinguir dois pontos em um objeto somente se a distância entre eles não for menor do que a metade do comprimento de onda da luz da imagem. 

Microscopia óptica de varredura de campo próximo: Primeiro método de microscopia de super-resolução, desenvolvido durante os anos 1980. 

Microscopia de localização fotoativada (PALM): Método de microscopia de super-resolução que desenvolvi. Usa moléculas fluorescentes para romper o limite de difração de Abbe. 

Fotodegradação: Fenômeno que ocorre em materiais fluorescentes e os impede de continuar brilhando depois de certo tempo. 

Conflito de interesses

O autor declara que a pesquisa foi realizada sem nenhuma relação financeira ou comercial capaz de gerar um conflito de interesses. 

Agradecimentos

Quero agradecer a Noa Segev por conduzir a entrevista que serviu de base para este artigo e pela coautoria do artigo; e a Alex Bernstein por fornecer as figuras. 

Materiais adicionais

[1] Eric Betzig e Harald Hess (Janelia Farm/HHMI): “Developing PALM microscopy.”

[2] Discurso Nobel do prof. Betzig.

Referências

[1] Ondrus, A. E., Hsiao-lu, D. L., Iwanaga, S., Parsons, W. H., Andresen, B. M., Moerner, W. E. et al. 2012. “Fluorescent saxitoxins for live cell imaging of single voltage-gated sodium ion channels beyond the optical diffraction limit.” Chem. Biol. 19:902–12. DOI: 10.1016/j.chembiol.2012.05.021.

[2] Ash, E. A. e Nicholls, G. 1972. “Super-resolution aperture scanning microscope.” Nature 237:510–2. DOI: 10.1038/237510a0. 

[3] Betzig, E., Harootunian, A., Lewis, A. e Isaacson, M. 1986. “Near-field diffraction by a slit: implications for superresolution microscopy.” Appl. Opt. 25:1890– 900. DOI: 10.1364/AO.25.001890.

[4] Betzig, E. e Chichester, R. J. 1993. “Single molecules observed by near-field scanning optical microscopy.” Science 262:142–5. DOI: 10.1126/science.262.5138.1422.

[5] Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W. e Prasher, D. C. 1994. “Green fluorescent protein as a marker for gene expression.” Science 263:802–5. DOI: 10.1126/science.8303295.

[6] Betzig, E. 1995. “Proposed method for molecular optical imaging.” Opt. Lett. 20:237–9. DOI: 10.1364/OL/20.000237.

[7] Patterson, G. e Lippincott-Schwartz, J. 2022. “A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.” Science 297:1873–1877. DOI: 10.1126/science.1074952.

[8] Shroff, H., White, H. e Betzig, E. 2013. “Photoactivated localization microscopy (PALM) of adhesion complexes.” Curr. Protocol. Cell Biol. 58:4–21. DOI: 10.1002/0471143030.cb0421s58.

[9] Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S. et al. 2006. “Imaging intracelular fluorescent proteins at nanometer resolution.” Science 313:1642–5. DOI: 10.1126/science.1127344.

[10] Liu, Z., Lavis, L. D. e Betzig, E. 2015. “Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level.” Mol. Cell. 58:644–59. DOI: 10.1016/j.molcel.2015.02.033.

[11] Li, D., Shao, L., Chen, B. C., Zhang, X., Zhang, M., Moses, B. et al. 2015. “Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.” Science 349:aab3500. DOI: 10.1126/science.aab3500.

Citação

Betzig, E. (2023). “Seeing beyond the limits with super-resolution microscopy.” Front. Young Minds. 11:1074453. DOI: 10.3389/frym.2023.1074453.

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